- 用于临床体外诊断（胶体金法、酶联免疫吸附法、电化学发光法）；
- 用于生物医药研发（基因工程药物研发、ADC药物研发）
- 用于肿瘤研究、免疫学研究等基础研究；申请具有自主知识产权的发明专利及科研奖项；
- 拓展研究思路、发表国际知名学术刊物。
- 羊驼/骆驼背景清晰：羊驼/骆驼健康适龄，可提供空白羊驼/骆驼进行免疫。
- 技术成熟：抗体库容量可以达到109,VHH抗体片段有效插入率﹥99%，并可以进行高通量筛选。
- 大规模制备：可利用原核/真核表达系统生产克级以上的抗体诊断原料。
| 步骤 | 周期 | 交付材料 |
| 1.动物免疫 | ||
| A.5次动物免疫 B.效价检测 C.PBMC分离 D.RNA提取 E.cDNA制备 |
92天 | 5次免疫效价检测数据 5次免疫之后的cDNA |
| 2.构建噬菌体抗体库 | ||
| A.利用免疫羊驼的cDNA，扩增出VHH基因片段，构建M13单链丝状噬菌体展示纳米抗体免疫文库; B.抗体库质量： （1）VHH抗体片段有效插入率﹥99%， （2）抗体库容量达到109 C.从文库中随机挑取96个克隆，对其中30个克隆测序，分析VHH抗体片段的多样性和正确率，保证正确率≥80%，另外提供30个克隆用于测序验证； |
4-6周 | 提供质检报告与抗体库 ①完整的项目报告和原始数据，报告需包含实验流程、分析评估实验的主要 操作步骤、以及详细的实验结果； ②共30个文库随机克隆的甘油菌和测序引物； ③噬菌体展示纳米抗体免疫文库的Kit（包含文库甘油菌1ml × 10支和文库噬菌粒质粒10 μg）； |
| 3.抗体库筛选 | ||
| A.筛选方案确定：根据项目实际情况，选择不同的筛选方案，如竞争筛选，固相筛选，液相筛选，细胞筛选，负筛选等筛选方法。 B.淘选： 对抗原蛋白进行SDS-PAGE分析验证，并进行生物素标记；针对生物素化靶点蛋白，利用链霉亲和素预包被的ELISA plates，淘筛免疫文库；抗原施压法进行2-3轮淘筛，确定充分富集且靶点筛选组的滴度要远高于对照筛选组。 C.结合筛选：选择从Output克隆中，分别挑取940个单克隆进行阳性克隆鉴定。经培养和phage rescue后，进行monoclonal phage ELISA检测。 D.测序分析:鉴定出抗原结合强阳性的VHH抗体克隆，测序分析，比对序列制作进化树，选择序列独特的克隆； E.表达验证：少量表达阳性VHH克隆，利用soluble ELISA检测对靶点抗原的特异性结合能力； |
6-8周 | 10个以上的特异性克隆 |
| 4.纳米抗体表达纯化 | ||
| A.将纳米抗体基因克隆至真核或原核表达载体。 | 2周 | 高纯度纳米抗体100-500ug |
| 5.亲和力测定 | ||
| 采用Biacore 测定抗体的亲和力/ 采用Nicoya LSPR 测定抗体的亲和力/ 采用Fortebio octet 测定抗体的亲和力 |
1周 1周 1周 |
亲和力测定数据 |
| 6.纳米抗体人源化（通过自主开发软件AbsYs分析抗体可变区并进行抗体人源化设计。） | ||
| A.识别FR、CDR、关键残基、PTMs。 B.通过同源比对，考虑可变区一致性及相似性、关 键残基、PTMs、稳定性等因素，选择更好的人源抗 体Germline FR作为模板，与羊驼CDR 重组，设计初 始人源化抗体。 C.分析抗体序列和结构，确定需要回复突变的关键 残基，设计不同数量的回复突变VH。 D.将人源化基因克隆至真核表达载体，转染293瞬时 表达获得100-500ug 纯化抗体。 E.结合活性及亲和力检测。 |
6-8周 | 至少一个人源化抗体（亲和力、表达量与原纳米抗体相当） |
本项目共免疫2只羊驼， 经过5次免疫后检测抗血清效价，结果显示，A, B-1（Fc tag）蛋白免疫动物后均产生了正常的免疫应答。重链抗体的效价较总IgG的效价低，4免后效价达到最高，建议结束免疫阶段实验，进入建库筛选阶段。