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01. 背景介绍

因此需要开发新型纳米材料作为识别分子模拟抗体并与靶株结合。例如，利用有机框架作为捕获元素，可以有效地提高ICA系统的灵敏度。引入对巯基苯基硼酸修饰的纳米材料代替传统探针，可以表现出良好的细菌捕获能力。同时，二维纳米材料，如过渡金属二硫族化合物和石墨烯，具有较大的表面积和较强的表面吸附能力。这些二维纳米片可以通过其大表面，依靠范德华力、静电和疏水相互作用非特异性地结合细菌。因此，这些独特的性质使这些二维纳米材料有可能在ICA中取代传统探针作为抗体替代者。

纳米酶，是具有类酶特性的纳米材料，是优秀的信号报告分子而被广泛应用于生物传感检测，治疗等领域。MnO2作为一种有前途的纳米材料因其形貌多样性和制备简单，独特的光学性质、吸附能力和优异的催化性能得到广泛研究，因此二维MnO2 NSs是无标记ICA的理想标签。

本研究首先利用具有良好细菌吸附能力、良好光信号和催化活性的MnO2 NSs作为无捕获抗体探针，设计了一种新型的无标记双信号ICA，用于灵敏快速检测肠炎沙门氏菌(S. enteritidis)。众所周知，肠炎沙门氏菌是致病菌引起的传染病的主要危险因素之一。一般来说，它可以通过食用受污染的动物源性食品(如肉、蛋和牛奶)传播给人类，导致数百万人患病，有时甚至造成严重和致命的后果。在这项工作中，仅使用一个单抗就能成功检测出肠炎沙门氏菌，具有良好的灵敏度和选择性。通过一步合成二维MnO2 NSs，可以同时提供三个功能:(1)作为细菌捕获的抗体替代者，(2)在ICA中提供强大的视觉信号，(3)通过浸泡放大模拟酶氧化酶活性产生额外的催化信号。因此，它已被选择并引入ICA作为检测食源性病原体的理想标签。如方案1所示，在检测过程中，在测试样品中加入适量的MnO2 NSs，经过一段时间的孵育后，MnO2 NSs会吸附在目标菌表面形成细菌材料复合物。然后，在毛细管力的作用下，复合物会从样品垫迁移到NC膜上。当复合物移动到T线时，预涂的抗S. enteritidis抗体会特异性结合检测靶点，并在T线上富集，形成棕色条带。因此，测试物质中目标细菌越多，T线颜色越深，呈正线性关系。此外，由于MnO2 NSs具有类似氧化酶的酶活性，TMB会被氧化为ox-TMB，形成蓝带，从而提高检测灵敏度。

要点: 通过透射电镜(TEM)对制备的MnO2 NSs形貌进行表征，可以看出MnO2 NSs为二维片状结构，平均尺寸约为250 nm(图1a和图1b)。MnO2纳米颗粒表面元素组成和化学状态的XPS全光谱如图所示，揭示了MnO2 NSs中存在Mn和O元素。此外，Mn 2p光谱的高分辨光谱(图1e)在653.9 eV和642.0 eV处的两个主峰分别归属于Mn 2p1/2和Mn 2p3/2轨道的Mn3+和Mn4+，这与之前报道的发现一致。在较高的Mn3+比例下，有更多的氧空位，使得制备的MnO2 NSs具有较高的催化活性。用x射线衍射(XRD)测定了合成的二氧化锰NSs的晶体结构。如图1c所示，XRD谱图显示，在22.01、37.32、39.69、56.03和65.81◦的2θ处分别形成(110)、(101)、(200)、(211)和(002)，与γ-MnO2的特征峰一致(PDF# 65-2821)。以上结果证明了二氧化锰纳米颗粒的成功制备。图1g显示，大量MnO2 NSs在肠炎沙门氏菌表面结合。这些结果表明MnO2 NSs具有与肠炎沙门氏菌相互作用的能力。图1i显示了MnO2 NSs、S. enteritidis和MnO2 NSs- S. enteritidis的电位。显然，与肠炎沙门氏菌结合后，电位从-31.77变为-23.50 mV。

要点：所制备的二氧化锰纳米酶的类似氧化酶的催化活性是实现原位放大比色信号的关键性质。图片显示MnO2 NSs氧化TMB生成蓝色氧化产物，在650 nm处出现明显的吸收峰(红线)。同时，在没有MnO2 NSs的情况下，TMB没有被氧化，溶液保持无色，在600-700 nm处没有出现峰(蓝线)。进一步，从图2b可以看出，随着MnO2 NSs浓度的增加，催化体系的吸光度逐渐增大，纳米酶的浓度与吸光度呈线性关系(图2c)。这些结果表明所制备的MnO2 NSs具有类似氧化酶的活性，可以催化TMB生成ox-TMB并触发视觉颜色信号。不同pH值下MnO2 NSs的催化能力不同。如图2d所示，当缓冲体系的pH为5时，催化活性最佳。此外，MnO2纳米酶耐极端温度，在30-100℃范围内催化活性没有明显变化，表明MnO2纳米酶比天然酶具有更高的耐温性(图2e)。根据酶动力学方程，可以定量评价MnO2 NSs的氧化酶活性。Km表示酶对底物的结合亲和力，Vmax表示酶的周转数，反映酶的生物催化活性。不同TMB浓度下MnO2 NSs的类氧化酶催化活性如图2f所示。测得MnO2 NSs的Km和Vmax分别为0.447 mM和14.9 × 10-8 Ms-1。与先前报道的一些复合纳米酶相比，MnO2 NSs的催化活性相当，甚至更好。以上结果证明类氧化酶MnO2 NSs具有相对稳定的催化性能，有利于构建稳定的MnO2纳米酶介导的视觉生物传感器。

要点：免疫层析分析的效果取决于合适的检测条件。因此，在107 cfu•mL-1肠炎沙门氏菌标准溶液中，选择MnO2 NSs的浓度和体积、孵育时间和免疫反应时间作为关键检测条件进行优化。

要点：如图直观观察到，在0 ~ 104 cfu•mL-1的检测范围内，随着细菌浓度的增加，T线上的棕色明显加深。当肠炎沙门氏菌浓度小于104 cfu•mL-1时，肉眼很难区分检测区域的颜色变化。进一步，受纳米酶介导的信号放大的启发，现有的检测结果被催化放大。催化后T线呈蓝色，检测范围扩大10倍。独立于其他设备，基于目测读数的检测限(LOD)在催化前后分别为104和103 cfu•mL-1，具有优异的灵敏度，可以满足现场检测和快速读数的需要。Image J软件分析显示，T线颜色强度与肠炎沙门氏菌浓度的对数呈良好的线性关系，可表示为y = 1837.55x-6681.89 (R2 = 0.988)，可对目标菌进行定量分析。在图片中，催化产生的比色信号也与肠炎沙门氏菌浓度的对数呈良好的线性关系:y = 2009.80x-5102.21 (R2 = 0.979)。

为了验证MnO2 NSs - ICA的特异性，对分析物与一系列干扰菌进行了交叉反应试验。如图所示，虽然干扰菌的浓度(108 cfu•mL-1)比肠炎沙门氏菌的浓度(107 cfu•mL-1)高10倍，但这些干扰菌对应的T线没有明显的信号。此外，在催化着色后，干扰菌株的T线仍无明显信号，表明该新型生物传感器对肠炎沙门氏菌具有良好的选择性。

要点：为了验证所开发的MnO2 NSs ICA的实际应用，选取了几个实际样品进行了测试。如图所示，对于不同的食品样品，测试结果与缓冲系统中的测试结果一致。随着细菌浓度的降低，T线棕色带的强度逐渐变弱，直到分别在橙汁、饮用水、牛奶和牛肉的LOD浓度为104、104、104和105 cfu•mL-1时停止。在TMB催化着色后，上述样品的LOD分别为103、103、103和104 cfu•mL-1，降低了10倍。

肠炎沙门氏菌免疫层析检测的LOD为103 cfu•mL-1，线性范围为103 -107 cfu•mL-1。ICA已成功应用于橙汁、饮用水、牛奶、牛肉样品中肠炎沙门氏菌的检测。综上所述，新型ICA在病原菌检测中具有普遍适用性，具有制备工艺简单、检测速度快、经济、灵活、便于推广应用等优点。遗憾的是，由于没有控制线，该平台可能会出现假阴性结果，我们正在进行后续工作来弥补这一不足。