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作者在CRISPR-RDB体系中采用了Cas12a，利用Cas12a在靶标识别后表现出的针对非特异单链DNA的反式剪切活性实现多重检测。首先，作者设计了四条序列不同的Biotin-recognition DNA（recDNA I、II、III和IV），及其相应的序列互补的捕获DNA（capDNA I、Ⅱ、III和Ⅳ）。recDNA I、II、III和IV分别与识别不同靶标序列的Cas12a/crRNA复合物孵育，形成单独的反应单元。将待测样本分别加入这4个反应单元，在对应靶标存在的情况下，Cas12a被激活并反式剪切recDNA；在对应靶标不存在的情况下，Cas12a不会被反式激活，相应的recDNA保持完整。反应结束后，将4个反应单元的产物混合，并与尼龙膜上包被的capDNA I、Ⅱ、III和Ⅳ孵育，完整的recDNA能与对应的capDNA互补结合，从而引入Biotin标记。Biotin标记的recDNA：capDNA双链可以结合streptavidin-HRP，将无色的TMB底物转化为蓝色。因此，蓝色指示对应靶标不存在；而白色指示对应靶标存在，且recDNA全部被反式剪切。

为了验证CRISPR-RDB体系的可行性，作者先将4种recDNA和4种capDNA杂交，结果表明每条带有4种capDNA的尼龙膜可识别到对应的recDNA，且recDNA I、II、III和IV之间没有干扰。 同时，作者测试了4个具有不同靶标序列识别能力的Cas12a/crRNA系统，显示能够在特异靶标存在的情况下剪切对应的recDNA。

为了提升CRISPR-RDB体系的检测性能，作者对其中的关键因素进行了优化，确认尼龙膜承载体积（每个正方形尺寸为0.5 cm×0.6 cm）为1 μL；capDNA（1 μL，10 μM）和recDNA（75 nM）之间杂交条件为35℃，40 min；Cas12a浓度对为100 nM；HRP孵育时间为20 min。

在上述优化的关键参数条件下，作者进一步测试了CRISPR-RDB体系的检测性能。作者采用RPA预扩增的方案进行靶标富集，随后用CRISPR-RDB体系对靶标浓度进行相对定量。如图展示了针对4种靶标病毒的RPA引物和crRNA设计方案。随后，对不同浓度（0、2.5、5、10、15、20 nM）靶标DNA进行检测，随着各靶标DNA浓度的增加，4个通道中的蓝点强度相应地逐渐变弱。使用智能手机应用程序对一系列靶标DNA浓度进行相对量化，结果显示在2.5–20 nM范围内具有良好的线性。进一步评估CRISPR-RDB对真实病毒样品的检测灵敏度，结果显示对不同浓度（0、2、4、6、8、10和100个拷贝）FA、FA、RSV和SARS-CoV-2样本有梯度检测结果，且检测限低至4个拷贝/μL。

为了探索CRISPR-RDB在真实临床样本中的应用，作者展示了工作流程图。其从样本到检测结果的时长大约为105 min，检测信号可以通过智能手机应用程序或肉眼来读取。对23个临床样本进行检测（1号：阴性对照；2–6号：FA阳性样本；7–11号：FB阳性样本；12–16号：新冠病毒阳性样本；17–23号：呼吸道合胞病毒阳性样本），并将检测结果与qPCR对比，结果显示，除19号样本外，其它临床样本检测结果一致。